. I n t r o d u c t i o n

P s e u d o g ym n o a s c u s d e s t r u c t a n s ( P d )i st h e e t i o l o g i c a g e n t o f w h i t e -n o s e s y n d r om e (WN S ) , a s k i n i n f e c t i o n o f h i b e r n a t i n g b a t s . T h i s p a t h o g e n h a s c a u s e d u n p r e c e d e n t e d r e d u c t i o n s i n t h e a b u nd a n c e o f t h e b a t p o p u l a t i o n s i n t h e n o r t h e a s t e r n U n i t e d S t a t e s s i n c e 2 0 0 6 , w i t h u p t o 9 5 % m o r t a l i t y i n s om e h i b e r n a c u l a ( B l e h e r t e t a l . , 2 0 0 9 ; C h a t u r v e d i e t a l . , 2 0 1 0 ; F r i c k e t a l . , 2 0 1 0 ; B l e h e r t , 2 0 1 2 ) . P di s a n ew l y r e c o g n i z e d f u n g u s t h a t i s w e l l a d a p t e d t o g r ow i n g u n d e r c o l d c o n d i t i o n s f o u n d i n c a v e s a n d m i n e s . I t s e c r e t s p r o t e o l y t i c e n z ym e s d o c um e n t e d i n o t h e r p a t h o g e n i c f u n g i t o c a u s e v e r t e b r a t e s k i n i n f e c t i o n s . T h e p a t h o g e n a p p e a r s t o h a v e a c l o n a l p o p u l a t i o n i n t h e U S ( R a j k um a r e t a l . , 2 0 1 1 ; R e n e t a l . , 2 0 1 2 ) . H ow e v e r , t h e p r e c i s e m e c h a n i sm s b y w h i c h P d s u r v i v e s a n d i n v a d e s t h e s k i n o f t h e h i b e r n a t i n g b a t s a r e n o t c l e a r . P h y l o g e n e t i c a n a l y s e s o f h i b e r n a c u l a s o i l r e v e a l e d l a r g e n um b e r o f P s e u d o g ym n o a s c u s s p p . , w h i c h h a v e n o t b e e n im p l i c a t e d i n WN S (M i n n i s a n d L i n d n e r , 2 0 1 3) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a tP d p o s s e s s c e r t a i n u n i q u e v i r u l e n c e r e p e r t o i r e t o c a u s e d i s e a s e i n b a t s , w h i c h s e em s t o b e m i s s i n g i n o t h e rP s e u d o g ym n o a s c u ss p p . I ti s a l s o c o n c e i v a b l e t h a t m amm a l i a n o r n o n -m amm a l i a n h o s t s a r ey e tt o b e i d e n t i fi e d f o r o t h e r P s e u d o g ym n o a s c u ss p p . R e c e n t l y , i n t e g r a t e d g e n om e p r o fi l e a n a l y s e s o f P d a n d G e om y c e s p a n n o r um( r e -n am e da sP s e u d o g ym n o a s c u s p a n n o r um ; a c c e s s i o n n o . A Y K R 0 0 0 0 0 0 0 0 ) y i e l d e d p r e l im i n a r y i n f o rm a t i o n o n t h e f u n d am e n t a l b i o l o g i c a l c a p a b i l i t i e s i n c l u d i n g p a t h o g e n i c i t y , c o l d a d a p t a t i o n , a n d r e g u l a t i o n m e c h a n i sm s ( C h i b u c o s e t a l . , 2 0 1 3 ) . H ow e v e r , f o l l ow -u p e x p e r im e n t a l s t u d i e s a r e n o t y e t p o s s ib l e d u e t o u n a v a i l a b i l i t y o f a n e f fi c i e n t t r a n s f o rm a t i o n s y s t em . T h e l a c k o f m o l e c u l a r t o o l s a l s o e x t e n d s t o o t h e r f u n g i i n h a b i t i n g t h e c o l d e n v i r o nm e n t .

T h e A g r o b a c t e r i um t um e f a c i e n s -m e d i a t e d t r a n s f o rm a t i o n s y st em ( A TM T ) h a s b e e n s u c c e s s f u l l y u s e d f o r m o l e c u l a r g e n e t i c s t u di e s o f y e a s t s a n d fi l am e n t o u s f u n g i , i n c l u d i n g S a c c h a r om y c e s( P i e r s e t a l . , 1 9 9 6 ) ,C r y p t o c o c c u s( M c C l e l l a n d e t a l . , 2 0 0 5) ,C o c c i d i o i d e s ( A b u o d e h e t a l . , 2 0 0 0 ) ,A s p e r g i l l u s( G o u k a e t a l . , 1 9 9 9 ; M i c h i e l s e e t a l . , 2 0 0 5 ) , T r i c h o p h y t o n ( Y am a d a e t a l . , 2 0 0 9 ) , F u s a r i um ( M u l l i n s e t a l . , 2 0 0 1) , G l om u s ( H e l b e r a n d R e q u e n a , 2 0 0 8) , O c u l im a c u l a( E c k e r t e t a l . , 2 0 0 5 ) a n dV e r t i c i l l i um( D o b i n s o n e t a l . , 2 0 0 4 ) . A TM T a l s o h a s b e e n s h ow n t o b e a n im p o r t a n t a l t e r n a t i v e t o o t h e r f u n g a l t r a n s f o rm a t i o n s y s t em s , a s i t y i e l d s a h i g h n um b e r o f t r a n s f o rm a n t s , i s e a s i e r t o p e r f o rm , d o e s n o t r e q u i r e s p e c i a l e q u i pm e n t , a n d i s c h a r a c t e r i z e d b y a h i g h f r e q u e n c y o f h om o l og o u s r e c om b i n a t i o n ( F r a n d s e n , 2 0 1 1 ) .

T h e e n z ym e u r e a s e e n c o d e d b yU R E 1g e n ei s a n im p o r t a n t v i ru l e n c e f a c t o r f o r t h e f u n g a l p a t h o g e n sC r y p t o c o c c u s n e o f o rm a n sa n d C o c c i d i o i d e s p o s a d a s i i ( O l s z ew s k i e t a l . , 2 0 0 4 ; M i r b o d -D o n o v a n e t a l . , 2 0 0 6 ) a n d t h e b a c t e r i a l p a t h o g e n sH e l i c o b a c t e r p y l o r i a n d P r o t e u s m i r a b i l i s ( J o n e s e t a l . , 1 9 9 0 ; E a t o n e t a l . , 1 9 9 1 ; T s u d a e t a l . , 1 9 9 4 ) . I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a tP da l s o s e c r e t e s s i g n i fi c a n t am o u n t s o f u r e a s e , b u t i t s p r e c i s e f u n c t i o n i n e i t h e r t h e s a p r op h y t i c o r p a r a s i t i c l i f e o f t h i s f u n g u s i s n o t c l e a r ( C h a t u r v e d i e t a l . , 2 0 1 0 ; R e y n o l d s a n d B a r t o n , 2 0 1 4 ) . a g a i n s t P d M 1 3 7 9 (h t t p : / /www . n c b i . n lm . n i h . g o v / n u c c o r e / A Y K P 0 0 0 0 0 0 0 0 ) a n d P p M 1 3 7 2 (h t t p : / /www . n c b i . n lm . n i h . g o v / n u c c o r e / A Y K R 0 0 0 0 0 0 0 0 ) d a t a b a s e s t o g e t f u l l -l e n g t h s e q u e n c e s ( C h i b u c o s e t a l . , 2 0 1 3 ) . O p e n r e a d i n g f r am e (O R F ) a n a l y s i s w a s c a rr i e d o u t u s i n g t h e p r o g r am s AUGU S TU S ( S t a n k e e t a l . , 2 0 0 4 ; S t a n k e a n d M o r g e n s t e r n , 2 0 0 5 ) a n d FG EN E SH ( www . s o f t b e r r y . c om) . G e n e m o d e l s w e r e m a n u a l l y c u r a t e d u s i n g e x o n / i n t r o n b o u n d a r y p r ed i c t i o n s f r om S P L I C E PO R T ( D o g a n e t a l . , 2 0 0 7) . M u l t i p l e s e q u e n c e a l i g nm e n t s w e r e c r e a t e d w i t h r e f e r e n c e t o s e l e c t e d G e n B a n k s e q u e n c e s u s i n g t h e M A F F T p r o g r am ( K a t o h e t a l . , 2 0 0 9 ) . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s u s i n g t h e n e i g h b o r -j o i n i n g (N J ) m e t h o d w i t h 1 0 0 0 b o o t s t r a p r e p l i c a t e s w a s d o n e u s i n g M EG A 4 . 1 ( T am u r a e t a l . , 2 0 0 7 ) .

) . T h e s e P C R am p l i c o n s w e r e c l o n e d i n t o t h e U r a c i l -S p e c i fi c E x c i s i o n R e a g e n t (U S E R ) -F r i e n d l y c l o n i n g v e c t o r p R F -HU 2 fl a n k i n g t h e h y g r om y c i n B r e s i s t a n c e ( H Y G) g e n e u n d e r t h e c o n t r o l o f t h eA s p e r g i l l u s n i d u l a n s t r p Cp r om o t e r a n d t e rm i n a t o r . T h e v e c t o r c o n t a i n e d t h e n e c e s s a r y e l em e n t s ( o r i Va n dt r f A ) f o r r e p l i c a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i

a n dA . t um e f a c i e n sc e l l s ( F r a n d s e n e t a l . , 2 0 0 8 ; Z h a n g e t a l . , 2 0 1 3 ) . T h e r e s u l t i n g p l a sm i d s w e r e d e s i g n a t e d a s p P d u r e 1 : :H Y G a n d p P p u r e 1 : :H Y Gg e n e d i s r u p t i o n c a s s e t t e s .

. 4 . A TM T t r a n s f o rm a t i o n p r o c e d u r e

T h e A TM T t r a n s f o rm a t i o n o fP da n dP pw a s c a r r i e do u t a s p e r p u b l i s h e d p r o t o c o l s ( G o u k a e t a l . , 1 9 9 9 ; M u l l i n s e t a l . , 2 0 0 1) . I n b r i e f , A . t um e f a c i e n s s t r a i n AG L -1 w a s t r a n s f o rm e d w i t h p P d u r e 1 : :H Y Ga n dP p u r e 1 : :H Y Gd i s r u p t i o n c a s s e t t e s b y e l e c t r o p o r at i o n ( M o z o a n d H o o y k a a s , 1 9 9 1) . T h e t r a n s f o rm e d AG L -1 c e l l s w e r e s u b s e q u e n t l y g r ow n i n Y E B b r o t h c o n t a i n i n g k a n am y c i n T h e c o -c u l t i v a t i o n e x p e r im e n t s w e r e p e r f o rm e d a t v a r i o u s t em p e r a t u r e s ( 1 0 -3 0 C ) a n d t im e i n t e r v a l s ( 2 4 -9 6 h ) . T h e m em b r a n e s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o PD A c o n t a i ni n g h y g r om y c i n ( 1 0 0 l g /m l ) a s a s e l e c t i o n a g e n t f o r t h e r e c o v e r y o f p u t a t i v e h y g r om y c i n p o s i t i v e (H y g + ) t r a n s f o rm a n t s a n d c e f o t a x im e ( 2 0 0 l g /m l ) t o k i l l t h eA . t um e f a c i e n sc e l l s . R e p r e s e n t a t i v e p l a t e s c o n t a i n i n g p u t a t i v e H y g + P d a n d P p t r a n s f o rm a n t s a r e s h ow n ( S u p p l em e n t a r y F i g . S 1 C a n d D ) . T h e p u t a t i v e H y g + t r a n s f o rm a n t s w e r e t h e n s t r e a k e d o n s e l e c t i o n m e d i um a n d p l a t e s w e r e i n c ub a t e d a t 1 5 C f o r 2 w e e k s . R e p r e s e n t a t i v e p l a t e s w i t h p u t a t i v e H y g + c o l o n i e s a r e s h ow n ( S u p p l em e n t a r y F i g . S 1 E a n d F ) .

O n e m i l l i l i t e r o f t h e c e l l c u l t u r e w a s s p u n d ow n a n d w a s h e d w i t h i n d u c t i o n m e d i um ( IM ) . B a c t e r i a l c e l l s w e r e d i l u t e d i n IM m e d i um ( 1 0 m l ) w i t h o r w i t h o u t 2 0 0l M a c e t o s y r i n g o n e ( A S ; S i gm a -

% i d e n t i t y ) . T h e s e q u e n c e s a l s o s h ow e d c o n s e r v a t i o n o f a l l o f t h e h i s t i d i n e r e s id u e s t h o u g h t t o b e i n v o l v e d i n b i n d i n g t o t h e n i c k e l m e t a l l o c e n t e r , b i n d i n g t o t h e s u b s t r a t e , a n d c a t a l y s i s ( C o x e t a l . , 2 0 0 0 )( F i g . 1 A ) . T h e s e r e s u l t s s t r e n g t h e n e d t h e o b s e r v a t i o n t h a tU

S o u t h e r n a n a l y s i s . T h e d a s h e d l i n e ( t h i c k ) r e p r e s e n t s g e n om i c s e q u e n c e s o u t s i d e o f t h e d i s r u p t i o n c a s s e t t e . T h e l o c a t i o n o f r e s t r i c t i o n e n z ym eP s t I w i t h i n t h e H Y Gg e n e o f t h e d i s r u p t i o n c a s s e t t e a n d a t t h e 5 0 e n d o f t h eU R E 1l o c u s , o u t s i d e o f t h e d i s r u p t i o n c a s s e t t e i s s h ow n . T h e d a s h e d l i n e ( t h i n ) r e p r e s e n t s e x p e c t e d s i z e p r o d u c t f o r m u t a n t s t r a i n s f o l l ow i n g e n z ym e d i g e s t i o n a n d S o u t h e r n a n a l y s i s . ( B )

A n a l y s i s o fu r e 1t r a n s f o rm a n t s b y P C R . P r im e r p a i r ( V 2 2 0 5 -V 2 2 0 6 ) t a r g e t i n g U R E 1fl a n k i n gH Y Gg e n e ( B i -3 . 0 k b i n s i z e f o r m u t a n t s a n d 8 6 0 b p i n s i z e f o r W T ) , p r im e r p a i r ( V 2 2 8 1 -V 2 2 8 2 ) l o c a t e d i n t h eH Y Gg e n e a n d r i g h

e i g h b o r -j o i n i n g m e t h o d ( S a i t o u a n d N e i , 1 9 8 7 ) r e v e a l e d t h a t P d U R E 1c l u s t e r e d c l o s e l y t o g e t h e r w i t h t h e o r t h o l o g o fP p U R E 1 , c o n s i s t e n t w i t h t h e i r c omm o n o r i g i n w i t h i n t h eP s e u d e u r o t i a c e a e ( F i g . 1 B ) .

. 2 . O p t im i z a t i o n o f

s i d e o f t h e d i s r u p t i o n c a s s e t t e . T h e l o c a t i o n o f r e s t r i c t i o n e n z ym eS a c I I w i t h i n t h e H Y Gg e n e a n d a t t h e 5 0 e n d o f t h eU R E 1l o c u s , o u t s i d e o f t h e d i s r u p t i o n c a s s e t t e i s s h ow n . ( B )

A n a l y s i s o f u r e 1t r a n s f o rm a n t s b y P C R . P r im e r p a i r ( V 2 2 0 1 -V 2 2 0 2 ) t a r g e t i n g U R E 1fl a n k i n gH Y Gg e n e ( B i -9 5 7 b p i n s i z e f o r W T a n d 2 6 9 4 b p i n s i z e f o r m u t a n t s t r a i n s ) , p r im e r p a i r s ( V 2 2 8 5 -V 2 2 8 6 ) l o c a t e d i n t h eH Y Gg e n e a n d i n t h e r i g h O f 1 2 8 p u t a t i v e H y g + P dt r a n s f o rm a n t s a n a l y z e d b y P C R w i t h p r im e r s e t ( V 2 2 0 5 -V 2 2 0 6 ) t a r g e t i n gU R E 1fl a n k i n gH Y Gg e n e , f o u r d i s p l a y e d a s i n g l e am p l i c o n o f 3 0 0 0 b p i n s i z e , w h e r e a s t h e W T s t r a i n d i s p l a y e d a s i n g l e am p l i c o n o f 8 0 0 b p i n s i z e , i n d i c a t i v e o f a h om o l o g o u s t r a n s f o rm a t i o n o f 3 . 1 % . R e s u l t s o f t h e s i n g l e i n t e g r at i o n e v e n t a r e s h ow n f o r tw o o f t h e s e m u t a n t s ( F i g . 3 A a n d B i ) . A l l o t h e r t r a n s f o rm a n t s h a d tw o am p l i c o n s o f 8 6 0 b p a n d 3 0 0 0 b p i n s i z e , i n d i c a t i v e o f e c t o p i c i n t e g r a t i o n ( d a t a n o t s h ow n ) . T h e t r a n sf o rm a n t s t h a t h a d s i n g l e am p l i c o n w e r e f u r t h e r c o n fi rm e d f o r t h e i n t e g r a t i o n o fP d u r e 1 : :H Y Ga t t h e h om o l o g o u s s i t e b y tw o a d d it i o n a l p r im e r s e t s . T h e p r im e r s e t ( V 2 2 8 1 -V 2 2 8 2 ) l o c a t e d w i t h i n t h e H Y Gg e n e a n d o n t h e r i g h t b o r d e r o u t s i d e o f t h e d i s r u p t i o n c a ss e t t e , y i e l d e d a 1 . 8 k b P C R am p l i c o n f o r m u t a n t s , b u t n o t f o r t h e W T s t r a i n ( F i g . 3 A a n d B i i ) . T h e p r im e r s e t ( V 2 2 0 3 -V 2 2 0 4 ) l o c a t e d w i t h i n t h e d e l e t e d r e g i o n o f U R E 1y i e l d e d a 3 1 8 -b p P C R am p l i c o n f o r W T s t r a i n , b u t n o t f o r m u t a n t s ( F i g . 3 A a n d B i i i ) . T h e s e m u t a n t s w e r e p a s s e d t h r o u g h s e v e r a l g e n e r a t i o n s o f g r ow t h o n Y PD a g a r , w h i c h i s a r i c h n o n -s e l e c t i v e m e d i um a n d t h u s , l i k e l y t o f a c i l i t a t e t h e l o s s o f a n y u n s t a b l e g e n e t i c c o n s t r u c t s . S o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n o fP s t I d i g e s t e d gDN A y i e l d e d s i n g l e b a n d o f 3 . 9 k b f o r b o t h t h e m u t a n t s , f u r t h e r c o n fi rm i n g g e n e r e p l a c em e n t a t t h e h om o l o g o u s s i t e w i t h o u t e c t o p i c i n t e g r a t i o n ( F i g . 3 A a n d C ) . T h e s e m u t a n t s w e r e l a b e l e d a s P d u r e 1 -1 0a n dP d u r e 1 -2 1 . T h e r a t i o n a l e f o r s e l e c t i o n o f tw o P d u r e 1m u t a n t s w a s t o t e s t i f b o t h m u t a n t s h a d c o n s i s t e n t p h en o t y p e s , a s t h e s e m u t a n t s d i d n o t c o n t a i n a f u n c t i o n a lU R E 1 .

O f 3 6P pH y g + t r a n s f o rm a n t s a n a l y z e d b y P C R w i t h p r im e r s e t ( V 2 2 0 1 -V 2 2 0 2 ) t a r g e t i n gU R E 1 fl a n k i n gH Y G g e n e , s i x d i s p l a y e d a s i n g l e am p l i c o n o f 2 6 9 4 b p i n s i z e , w h e r e a s t h e W T s t r a i n h a d a s i n g l e am p l i c o n o f 9 5 7 b p i n s i z e , i n d i c a t i v e o f a h om o l o g o u s i n t e g r a t i o n o f 1 6 . 7 % . R e s u l t s o f t h e s i n g l e i n t e g r a t i o n e v e n t a r e s h ow n f o r tw o o f t h e s e m u t a n t s ( F i g . T h e P d u r e 1 a n d P p u r e 1 m u t a n t s w e r e a s s e s s e d f o r u r e a s e e n z ym e a c t i v i t y a l o n g w i t h t h e i r r e s p e c t i v e W T s t r a i n s . I t w a s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e P dW T a n d P d u r e 1m u t a n t s t r a i n s g r ew r e l a t i v e l y b e t t e r t h a n t h eP pW T a n d P p u r e 1m u t a n t s t r a i n s o n C h r i s t e n s e n ' s u r e a a g a r . D e s p i t e g r ow t h d i f f e r e n c e s , n o c o l o r d e v e lo pm e n t a f t e r 2 w e e k s o f i n c u b a t i o n , c o n fi rm e d t h a t t h eU R E 1g e n e w a s f u n c t i o n a l l y d e l e t e d i n b o t h P d u r e 1 a n d P p u r e 1 m u t a n t s ( F i g s . 5 A a n d6 A ) . T h e s e r e s u l t s w e r e f u r t h e r c o r r o b o r a t e d b y m e as u r em e n t s o f u r e a s e e n z ym e a c t i v i t y i n c e l l l y s a t e s p r e p a r e d f r om P d u r e 1o rP p u r e 1m u t a n t s . U r e a s e a c t i v i t y o f t h e W T s t r a i n s o f P d a n dP pw a s 9 7 4 ± 1 1 3 U / g a n d 1 2 0 5 ± 1 2 1 U / g , r e s p e c t i v e l y . I n c o nt r a s t , u r e a s e a c t i v i t y w a s u n d e t e c t a b l e i nP d u r e 1 a n d P p u r e 1 m u t a n t s ( F i g s . 5 B a n d6 B ) . F i n a l l y , w e t e s t e d w h e t h e r t h eU R E 1 g e n e i s i n v o l v e d i n u r e a m e t a b o l i sm i n t h e s e tw o o r g a n i sm s . P p u r e 1m u t a n t s f a i l e d t o g r ow o n YN B -U a s c om p a r e d t o t h e P p W T s t r a i n (F i g . 6 C ) . I n c o n t r a s t , p o o r b u t d e t e c t a b l e g r ow t h o f P d u r e 1m u t a n t s w a s o b s e r v e d o n YN B -U (F i g . 5 C ) . T o f u r t h e r a n al y z e t h i s d i s c r e p a n t r e s u l t , w e t e s t e dP dW T a n d P d u r e 1m u t a n t s t r a i n s o n YN B a g a r d e v o i d o f u r e a . S im i l a r p o o r g r ow t h o f W T a n d m u t a n t s t r a i n s o b s e r v e d i n d i c a t i n g t h a t t h e g l u c o s e i n t h e YN B m e d i um p o s s i b l y s u p p o r t s m i n im a l g r ow t h o fP db u t n o tP p s t r a i n s ( S u p p l em e n t a r y F i g . S 2 ) . T h e s e r e s u l t s f u r t h e r c o r r o b o r a t e d o u r fi n d i n g s r e g a r d i n gP d u r e 1m u t a n t s , a s P p u r e 1m u t a n t s w e r e u n a b l e t o u t i l i z e u r e a , c o n fi rm i n g t h a t t h eU R E 1g e n e i s i n v o l v e d i n u r e a m e t a b o l i sm i n b o t h P da n dP p . c i p i e n t c e l l s ( F u l l n e r a n d N e s t e r , 1 9 9 6 ; B a r o n e t a l . , 2 0 0 1 ; S u g u i e t a l . , 2 0 0 5# 8 7 1 ) . A p a r t f r om t emp e r a t u r e ,A g r o b a c t e r i um -m e d i a t e d t r a n s f o rm a t i o n s h ow e d s t r o n g c o r r e l a t i o n w i t h t h e d u r a t i o n o f c o -c u l t i v a t i o n a n d t h e p r e s e n c e o f A S . T h e s e r e s u l t s a r e i n a g r e em e n t w i t h o t h e r f u n g a l p a t h o g e n s i n d i c a t i n g t h a t t h e p a t hw a y s l e a d i n g t o T -DN A i n s e r t i o n a r e c o ns e r v e d a c r o s s f u n g a l s p e c i e s ( P i e r s e t a l . , 1 9 9 6 ; G o u k a e t a l . , 1 9 9 9 ; A b u o d e h e t a l . , 2 0 0 0 ; Y am a d a e t a l . , 2 0 0 9 ) .

. 4 . G r ow t h a n d s p o r u l a t i o n

. D i s c u s s i o n T h e h i g h l i g h t o f t h i s s t u d y w a s t h e s u c c e s s f u l u s e o f t h e

W e a l s o f o u n d t h a t h om o l o g o u s g e n e i n t e g r a t i o n w a s l ow e r i n P d( 3 . 1 % )t h a ni n P p( 1 6 . 7 % ) . I t i s im p o r t a n t t o p o i n t o u t t h a t t h e h om o l o g o u s a rm o f t h eU R E 1g e n e w a s c h o s e n f r om t h e s am e s t r a i n u s e d f o r t r a n s f o rm a t i o n , a s s t r i c t s e q u e n c e i d e n t i t y i s r e q u i r e d f o r h i g h e f fi c i e n c y h om o l o g o u s r e c om b i n a t i o n i n o t h e r f u n g a l p a t h og e n s ( S u d a r s h a n e t a l . , 1 9 9 9 ; N a r a s i p u r a e t a l . , 2 0 0 3 , 2 0 0 5 ) . T h e G + C c o n t e n t a p p e a r s t o b e i d e n t i c a l b e tw e e nP da n dP p( C h i b u c o s e t a l . , 2 0 1 3 ) , s u c h t h a t t h i s d o e s n o t a p p e a r t o b e a l i k e l y f a c t o r a f f e c t i n g l ow h om o l o g o u s g e n e i n t e g r a t i o n o b s e r v e d i nP d .

T h e a v a i l a b i l i t y o f a s im p l e p h e n o t y p i c t e s t ( c o l o r c h a n g e i n C h r i s t e n s e n ' su r e a a g a r ) w a s a c o n s i d e r a t i o n f o r c h o o s i n g t h e U R E 1g e n e e n c o d i n g u r e a s e f o r g e n e d i s r u p t i o n s t u d i e s i n t h e p r es e n t i n v e s t i g a t i o n . O t h e r s a n d w e h a v e d em o n s t r a t e d t h a tP d s e c r e t e s a l a r g e am o u n t o f u r e a s e i n t o t h e g r ow t h m e d i um ( C h a t u r v e d i e t a l . , 2 0 1 0 ; R a u d a b a u g h a n d M i l l e r , 2 0 1 3 ) . T h e r o l e o f u r e a s e i n t h e f u n g a l a n d b a c t e r i a l v i r u l e n c e h a s b e e n i n v e s t ig a t e d u s i n g d i f f e r e n t v e r t e b r a t e m o d e l s ( J o n e s e t a l . , 1 9 9 0 ; E a t o n e t a l . , 1 9 9 1 ; C o x e t a l . , 2 0 0 0 ; M i r b o d -D o n o v a n e t a l . , 2 0 0 6 ) . C u r r e n t l y , t h e r e a r e n o l a b o r a t o r y m o d e l s a v a i l a b l e f o r WN S o r f o r t e s t i n g t h e p a t h o g e n i c p o t e n t i a l o f P d u r e 1a n dP p u r e 1m u t a n t s t r a i n s . A l t h o u g h , a r e c e n t s t u d y d em o n s t r a t e d t h a t e x p e r im e nt a l l y i n f e c t e d b a t s w i t hP dd e v e l o p WN S ( L o r c h e t a l . , 2 0 1 1 ) ,