Duplex Stem Replacement with bPNA+ Triplex Hybrid Stems Enables Reporting on Tertiary Interactions of Internal RNA Domains 05/30/2019 10098458 10.1021/jacs.9b03435 Journal of the American Chemical Society 0002-7863 141 23 Shiqin MiaoYufeng LiangIla MaratheJie MaoChris DeSantisDennis Bong

d u e t o i t s c a t i o n i c amm o n i um s i d e c h a i n a t n e u t r a l pH . F u r t h e r , w e e v a l u a t e t h e DN A a n d RN A b i n d i n g p r o p e r t i e s o f b PN A + a n d d em o n s t r a t e i t s u t i l i t y f o r i n s t a l l i n gfl u o r e s c e n t r e p o r t e r s o f t e r t i a r y RN A i n t e r a c t i o n s a t i n t e r n a l l o c a t i o n s w i t h i n f o l d e d RN A v i a r e p l a c em e n t o f 6 b p s t em s w i t h b PN A + t r i p l e x h y b r i d s t em s t h a t a r e r o u g h l y e q u i v a l e n t i n s i z e .

■ R E S U L T S A N D D I S C U S S IO N T o d e t e rm i n e t h e o p t im um s i d e c h a i n l e n g t h f o r DN A b i n d i n g , p e p t i d e s w e r e p r e p a r e d b e a r i n g e i t h e r d i am i n o b u t y r i c a c i d ( B ) , o r n i t h i n e (O ) , o r l y s i n e ( K ) w i t h 2 , 3 , a n d 4 c a r b o n l i n k e r s b e t w e e n t h eδ -c a r b o n a n d t h e s i d e c h a i n p r im a r y am i n e , r e s p e c t i v e l y . T h e s e p e p t i d e s w e r e s u b j e c t e d t o r e d u c t i v e a l k y l a t i o n 3 2 -3 4 w i t h m e l am i n e a c e t a l d e h y d e t o y i e l d l y s i n e ( K 2M ) , o r n i t h i n e (O 2M ) , a n d d i am i n o b u t y r i c a c i d ( B 2M )a t a l t e r n a t e p o s i t i o n s ( S c h em e 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , m e l am i n e a c e t a l d e h y d e1a p p e a r s t o e x i s t a s a c y c l i c h em i am i n a l -t y p e s t r u c t u r e i n DM SO b u t n e v e r t h e l e s s r e a c t s a s e x p e c t e d i n t h e a l k y l a t i o n ( S u p p o r t i n g I n f o rm a t i o n ) . O u r i n i t i a l s t u d i e s f o c u s e d o n h e x a p e p t i d e c o r e s o f 3 d y a d r e p e a t s w i t h 2Mb e a r i n g r e s i d u e s a t a l t e r n a t e p o s i t i o n s w i t h n a t i v e am i n o a c i d r e s i d u e s ( g l u t am a t e o r s e r i n e ) . A s e a c h p e p t i d e h a s 6 m e l am i n e r i n g s d i s p l a y e d , w e t e s t e d b i n d i n g t o T 6 C 4 T 6 DN A b y t h e rm a l d e n a t u r a t i o n (U V m e l t ) , d i ff e r e n t i a l s c a n n i n g c a l o r im e t r y (D S C ) , a n dfl u o r e s c e n c e a n i s o t r o p y . I n t e r e s t i n g l y , w h i l e t h e O 2M a n d K 2M p e p t i d e s e x h i b i t e d s im i l a r m e l t t r a n s i t i o n s ( T m ∼ 6 0°C ) , t h e B 2M p e p t i d e s w e r e l e s s t h e rm a l l y s t a b l e b y∼ 1 0°C , i n d i c a t i n g a s i g n i fi c a n t l o s s o f f u n c t i o n w h e n t h e s i d e c h a i n i s s h o r t e n e d b y o n e a t om ( T a b l e 1 ) . B o t h z w i t t e r i o n i c g l u t am a t e a n d c a t i o n i c s e r i n e p e p t i d e s w e r e e a s i l y s o l u b l e , t h o u g h t h e s e r i n e p e p t i d e s ( S K 2M ) 3 e x h i b i t e d s t r o n g e r DN A b i n d i n g , p r e s um a b l y d u e t o f a v o r a b l e e l e c t r o s t a t i c s ( T a b l e 1 ) . T h i s t r e n d h e l d f o r l o n g e r p e p t i d e s w i t h ( S K 2M ) 5 b i n d i n g DN A m o r e t i g h t l y t h a n a n d ( E K 2M ) 5 . T o c o n fi rm t h a t t h e m e l am i n e r i n g s d r i v e s e l e c t i v e b i n d i n g b y b a s e t r i p l e f o rm a t i o n r a t h e r t h a n e l e c t r o s t a t i c s , t h e p K A o f a m o d e l 2 M c om p o u n d w a s d e t e rm i n e d . Aδ -l i n k e d amm o n i um i o n i s k n o w n t o d e c r e a s e t h e p K A o f t h e p r o t o n a t e d m o n o a l k y l m e l am i n e f r om 5 . 3 t o 4 . 5 , 3 5 a n d t h e c l o s e l i n k a g e o f t w o m e l am i n e s r e s u l t s i n a f u r t h e r a p p a r e n t p K A d e c r e a s e t o 3 . 9 ( S u p p o r t i n g I n f o rm at i o n ) . T h u s , t h e m e l am i n e r i n g s i n K 2M a r e e v e n l e s s b a s i c t h a n w e l l -s t u d i e d s y s t em f r om t h e C o l E 1 p l a sm i d , 3 6 , 3 7 w h i c h r e g u l a t e s t r a n s c r i p t i o n i n p a r t t h r o u g h t h e f o rm a t i o n o f a n RN A h a i r p i n h e t e r o d im e r i c k i s s i n g c om p l e x t h a t i s s u bs e q u e n t l y s t a b i l i z e d b y b i n d i n g a n a t i v e p r o t e i n , R o p . T h e b i n d i n g o f i s o l a t e d RN A h a i r p i n s f r om t h e C o l E 1 p l a sm i d a s w e l l a s R o p b i n d i n g t o t h e h a i r p i n h e t e r o d im e r h a v e b e e n s t u d i e d e x t e n s i v e l y b y T om i z a w a a n d c o w o r k e r s . 3 7 , 3 8 F u r t h e r , t h e C o l E 1 RN A k i s s i n g l o o p a n d v a r i a n t s w e r e am o n g t h e fi r s t RN A s y s t em s t o b e s t r u c t u r a l l y c h a r a c t e r i z e d b y C r o t h e r s a n d c o w o r k e r s . 3 9 , 4 0 T h e RN A -p r o t e i n i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e k i s s i n g l o o p d im e r a n d R o p p r o t e i n h a s a l s o b e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d ; 3 6 t h i s s y s t em h a s t h u s y i e l d e d f o u n d a t i o n a l i n f o rm a t i o n r e g a r d i n g RN A t e r t i a r y i n t e r a c t i o n s . T h e C o l E 1 h a i r p i n s RN A 1 a n d RN A 2 , w h i c h t o g e t h e r f o rm a h e t e r o d im e r v i a c om p l em e n t a r y b a s e -p a i r i n g b e t w e e n t h e 7 n u c l e o t i d e l o o p r e g i o n s , w e r e r e d e s i g n e d t o i n s e r t U 6 /U 6 d om a i n s i n b e t w e e n t h e 6 -7 b p d u p l e x s t em a n d t h e 7 -n t l o o p r e c o g n i t i o n e l em e n t ( F i g u r e 3 ) . B o t h U 6 -h a i r p i n RN A s d e r i v e d f r om RN A 1 a n d RN A 2 s h i f t e d c l e a n l y o n g e l u p o n c om p l e x a t i o n w i t h fl u o r o p h o r e -t a g g e d ( S K 2M ) 3 w i t h a p p a r e n t K d i n t h e l o w n a n om o l a r r a n g e ( F i g u r e 3 , S u p p o r t i n g I n f o rm a t i o n ) . I n t e r e s ti n g l y , a l t h o u g h t h e RN A 1 -U 6 h a i r p i n a l o n e e x h i b i t e d a b r o a d m e l t i n g w i t h t w o a p p a r e n t t r a n s i t ( E K M ) 6 3 8 1 2 7 3 2 ( E B 2M ) 3 / ( S B 2M ) 3 4 8 / 5 5 9 5 / 8 4 1 3 / 0 . 2 d ( EO 2M ) 3 / ( SO 2M ) 3 5 8 / 6 2 1 0 2 / 1 1 1 6 / 0 . 2 d ( E K 2M ) 3 / ( S K 2M ) 3 6 0 / 6 5 1 1 9 / 1 1 6 1 6 / 0 . 0 2 d ( E K 2M ) 5 / ( S K 2M ) 5 6 9 / 7 8 1 9 1 / 1 4 7 0 . 0 6 / 0 . 0 1 0 2 1 / j a c s . 9 b 0 3 4 3 5 J 0 3 4 3 5 m e n t i s a m i n o r s t r u c t u r a l p e r t u r b a t i o n o f a n e x i s t i n g s t r u c t u r a l e l em e n t , u n l i k e d u p l e x s t r a t e g i e s 4 2 t h a t a d d a n e w s t r u c t u r a l e l em e n t w i t h i n f o l d e d l n c RN A . W e t e s t e d t h i s n o t i o n u s i n g a w e l l -s t u d i e d i n t r am o l e c u l a r t e r t i a r y i n t e r a c t i o n b e t w e e n a G A A A t e t r a l o o p ( T L ) a n d 1 1 n t t e t r a l o o p r e c e p t o r ( T L R ) f o u n d i n s e v e r a l d om a i n s o f g r o u p I a n d g r o u p I I i n t r o n s a s w e l l a s RN a s e P 4 3 , 4 4 t h a t h a s p r o v e d u s e f u l f o r e n g i n e e r i n g RN A s t r u c t u r e s . 4 5 T h i s w i d e l y o b s e r v e d n a t i v e i n t e r a c t i o n r e q u i r e s 5 -1 0 mM M g 2 + t o f o rm i n i n v i t r o e x p e r im e n t s . B a s e d o n p r i o r r e p o r t s , 4 5 , 4 6

r i p l e x h y b r i d d om a i n . F u r t h e r , w h i l e t h e o v e r a l l c h a n g e i n T m w a s m o d e s t , p e p t i d e c om p l e x a t i o n r e s u l t e d i n c o n s i d e r a b l e q u a l i t a t i v e s h a r p e n i n g o f t h e t r a n s i t i o n a n d i n c r e a s e i n U V a b s o r b a n c e c h a n g e , i n l i n e w i t h e x p e c t a t i o n s b a s e d o n K Mb PN A . W i t h RN A -b PN A + b i n d i n g c o nfi rm e d , t h e ( S K 2M ) 3 p e p t i d e c o r e w a s c a p p e d w i t h C y 3 o r C y 5 d y e s t o t e s t t h e e x t e n t t o w h i c h l a b e l e d RN A l o o p s c o u l d p r o v i d efl u o r e s c e n c e r e p o r t i n g o f l o o p i n t e r a c t i o n s . T h e C y -b PN A + p e p t i d e s w e r e t r i p l e x h y b r i d i z e d w i t h RN A 1 -U 6 a n d RN A 2 -U 6 i n a s i n g l e m i x i n g e x p e r im e n t , w h i c h i s e x p e c t e d t o r e s u l t i n r a n d om s o r t i n g o f t h e t w o b PN
w e d e s i g n e d T L -T L R s i t e s o n a d j a c e n t RN A h e l i c e s w i t h a s h o r t l i n k e r a n d U 6 -s t em r e p l a c em e n t a n d i n s e r t i o n a t t h e h e l i c e s s u p p o r t i n g t h e T L a n d T L R ( S c h em e 2 ) . I k a w a e t a l . d e s i g n e d a s e l f -f o l d i n g RN A s y s t em t h a t i n c o r p o r a t e d s t r u c t u r a l e l em e n t s f r om t h e T e t r a h ym e n ag r o u p I r i b o z ym e s u c h a s t h e T L / T L R m o d u l e a n d a t r i p l e h e l i c a l s c a ff o l d t h a t s u p p o r t s t h e 1 1 n t T L R . T h i s s y s t em w a s f o u n d t o e n g a g e i n a m a g n e s i um -d e p e n d e n t , i n t r am o l e c u l a r T L / T L R b i n d i n g e v e n t , c o n c om i t a n t w i t h r e a r r a n g em e n t o f t h e t r i p l e h e l i x s c a ff o l d i n t o c o a x i a l l y s t a c k e d h e l i c e s . 4 5 T h i s e n g i n e e r e d s y s t em c o n t a i n i n g n a t i v e s t r u c t u r a l f e a t u r e s w a s a n i d e a l p l a t f o rm t o t e s t b PN A + r e p o r t i n g . N o t a b l y , P 2 o f t h i s s y s t em , w h i c h s u p p o r t s t h e G A A A t e t r a l o o p , i s 1 2 b p l o n g a n d e a s i l y a c c omm o d a t e s 6 b p s t em r e p l a c em e n t b PN A + l a b e l i n g . F o r t h e T L R , w e c h o s e t o l e a v e P 3 u n d i s t u r b e d a s i t c o n t a i n s t h e t r i p l e h e l i x s c a ff o l d , a n d i n s t e a d i n s e r t e d a U -l o o p f o r b PN A + b i n d i n g d i s t a l t o P 3 ( S c h em e 2 ) . T h u s , f o rm a t i o n o f t h e T L -T L R c om p l e x i n t h i s c o n s t r u c t i s e x p e c t e d t o b e u n d i s t u r b e d a s t h e p h y s i c a l d i s t a n c e s e p a r a t i n g t h e G A A A t e t r a l o o p f r om t h e T L R h a s n o t b e e n a l t e r e d s i g n i fi c a n t l y , a n d c o a x i a l s t a c k i n g o f t h e P 2 a n d P 3 h e l i c a l s u b u n i t s s h o u l d p r o c e e d a s d e s i g n e d . 4 5 , 4 7 W e m a i n t a i n e d d e s i g n s im p l i c i t y b y u s i n g U 6 d om a i n s a t b o t h l o c a t i o n s . T h o u g h w e a n t i c i p a t e d r a n d om d i s t r i b u t i o n o f b PN A s b e t w e e n t h e t w o s e q u e n c e i d e n t i c a l U 6 s i t e s , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e s t r u c t u r a l c o n t e x t o f t h e s i t e s c r e a t e s a p r e f e r r e d b i n d i n g s i t e . I t w a s n o t a p p a r e n t i f o n e o f t h e t w o s i t e s w a s p r e f e r r e d ; t h e RN A c o n s t r u c t w a s n o n e t h e l e s s i n c u b a t e d w i t h C y 3a n d C y 5l a b e l e d( S K 2M ) 3 b PN A + s e q u e n t i a l l y t o a l l o w s i t e s a t u r a t i o n . G r a t i f y i n g l y , a F R E T s i g n a l w a s i n d e e d o b s e r v e d a s a f u n c t i o n o f m a g n e s i um w i t h m a x im um C y 3 d o n o r q u e n c h i n g a n d C y 5 a c c e p t o r em i s s i o n a t ∼ 5 mM M g 2 + , c o n s i s t e n t w i t h p r i o r r e p o r t s o n t h e T L / T L R i n t e r a c t i o n ( F i g u r e 6 ) . T h i s r e s u l t e x t e n d s t h e s c o p e o f o u r

b PN A l a b e l i n g s t r a t e g y t o i n t r am o l e c u l a r RN A t e r t i a r y c o n t a c t s , i n c l u d i n g n o t o n l y i n t e r n a l l o o p s b u t a u b i q u i t o u s t e t r a l o o p r e c e p t o r m o t i f . ■ CO N C L U S IO N S 2 0 0 9 ,1 3 1 ,( J o u r n a l o f t h e Am e r i c a n C h em i c a l S o c i e t y A r t i c l e D O I :1 0 . 1 0 2 1 / j a c s . 9 b 0 3 4 3 5 J . Am . C h em . S o c . X X X X , X X X , X X X -X X X

W e s y n t h e s i z e d a n d e v a l u a t e d a f am i l y o f n e w b PN A p e p t i d e s c a l l e d b PN A + t h a t d i s p l a y t w o b a s e -t r i p l e f o rm i n g m e l am i n e r i n g s p e r s i d e c h a i n o n a t e r t i a r y am i n e c e n t e r t h a t i s c a t i o n i c v i a p r o t o n a t i o n a t pH 7 . 4 . T h i s c h a r g e d r e s i d u e a ff o r d s p e p t i d e s o l u b i l i t y , a l l o w i n g u s e o f n e u t r a l s i d e c h a i n r e s i d u e s a t n o nb a s e -t r i p l i n g p o s i t i o n s . W e d em o n s t r a t e d t h a t t h e n e w K
r a t e d t h a t t h i s m e t h o d c o u l d b e u s e d t o o b t a i nfl u o r e s c e n t r e a d -o u t o f c omm o n RN A t e r t i a r y i n t e r a c t i o n s s u c h a s RN A -RN A k i s s i n g l o o p f o rm a t i o n , RN A -p r o t e i n , a n d t e t r a l o o p / t e t r a l o o p r e c e p t o r b i n d i n g . T h i s b i o c h em i c a l m e t h o d f o r l a b e l i n g i n t e r n a l RN A l o o p s v i a t a r g e t i n g t o a c om p a c t , g e n e t i c a l l y e n c o d e d b i n d i n g s i t e i s a t e c h n i c a l l y c o n v e n i e n t a l t e r n a t i v e ( i f b PN A i s a v a i l a b l e ) t o c o v a l e n t c h em i c a l m o d i fi c a t i o n o f RN A , 3 0 , 3 1 w h i c h r e q u i r e s s p e c i a l i z e d e x p e r t i s e o r m a y b e l im i t e d t o s p e c i fi c s e q u e n c e s . F u r t h e rm o r e , t h e s t em r e p l a c em e n t m e t h o d f o r p r o b e i n s t a l l a t i o n a t a n i n t e r n a l s i t e m a y b e c om b i n e d w i t h e s t a b l i s h e d m e t h o d s f o r RN

D O I :1 0 . 1 0 2 1 / j a c s . 9 b 0 3 4 3 5 J . Am . C h em . S o c . X X X X , X X X , X X X -X X X