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Title: Robust estimation of bacterial cell count from optical density
Abstract

Optical density (OD) is widely used to estimate the density of cells in liquid culture, but cannot be compared between instruments without a standardized calibration protocol and is challenging to relate to actual cell count. We address this with an interlaboratory study comparing three simple, low-cost, and highly accessible OD calibration protocols across 244 laboratories, applied to eight strains of constitutive GFP-expressingE. coli. Based on our results, we recommend calibrating OD to estimated cell count using serial dilution of silica microspheres, which produces highly precise calibration (95.5% of residuals  <1.2-fold), is easily assessed for quality control, also assesses instrument effective linear range, and can be combined with fluorescence calibration to obtain units of Molecules of Equivalent Fluorescein (MEFL) per cell, allowing direct comparison and data fusion with flow cytometry measurements: in our study, fluorescence per cell measurements showed only a 1.07-fold mean difference between plate reader and flow cytometry data.

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PAR ID:
10192913
Author(s) / Creator(s):
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Publisher / Repository:
Nature Publishing Group
Date Published:
Journal Name:
Communications Biology
Volume:
3
Issue:
1
ISSN:
2399-3642
Format(s):
Medium: X
Sponsoring Org:
National Science Foundation
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  1. ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; et al ( , Synthetic Biology)
    Abstract

    Plate readers are commonly used to measure cell growth and fluorescence, yet the utility and reproducibility of plate reader data is limited by the fact that it is typically reported in arbitrary or relative units. We have previously established a robust serial dilution protocol for calibration of plate reader measurements of absorbance to estimated bacterial cell count and for green fluorescence from proteins expressed in bacterial cells to molecules of equivalent fluorescein. We now extend these protocols to calibration of red fluorescence to the sulforhodamine-101 fluorescent dye and blue fluorescence to Cascade Blue. Evaluating calibration efficacy via an interlaboratory study, we find that these calibrants do indeed provide comparable precision to the prior calibrants and that they enable effective cross-laboratory comparison of measurements of red and blue fluorescence from proteins expressed in bacterial cells.

     
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  2. ; ( , Current Protocols in Cytometry)
    Abstract

    Use of flow cytometry to analyze small particles has been implemented for several decades. More recently, small particle analysis has become increasingly utilized owing to the increased sensitivity of conventional and commercially available flow cytometers along with growing interest in small particles such as extracellular vesicles (EVs). Despite an increase in small particle flow cytometry utilization, a lack of standardization in data reporting has resulted in a growing body of literature regarding EVs that cannot be easily interpreted, validated, or reproduced. Methods for fluorescence and light scatter standardization are well established, and the reagents to perform these analyses are commercially available. Here, we describe FCMPASS, a software package for performing fluorescence and light scatter calibration of small particles while generating standard reports conforming to the MIFlowCyt‐EV standard reporting framework. This article covers the workflow of implementing calibration using FCMPASSas follows: acquisition of fluorescence and light scatter calibration materials, cataloguing the reference materials for use in the software, creating cytometer databases and datasets to associate calibration data and fcs files, importing fcs files for calibration, inputting fluorescence calibration parameters, inputting light scatter calibration parameters, and applying the calibration to fcs files. Published 2020. U.S. Government.

    Basic Protocol 1: Acquisition and gating of light scatter calibration materials

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    Basic Protocol 4: Cataloguing fluorescence calibration materials

    Basic Protocol 5: Creating cytometer databases and datasets

    Basic Protocol 6: Importing fcs files

    Basic Protocol 7: Fluorescence calibration

    Basic Protocol 8: Light scatter calibration

    Basic Protocol 9: Performing and reporting fcs file calibration

     
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  3. ; ; ; ( , Cytometry Part A)
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    Fluorescence lifetime measurements provide information about the fluorescence relaxation, or intensity decay, of organic fluorophores, fluorescent proteins, and other inorganic molecules that fluoresce. The fluorescence lifetime is emerging in flow cytometry and is helpful in a variety of multiparametric, single cell measurements because it is not impacted by nonlinearity that can occur with fluorescence intensity measurements. Yet time‐resolved cytometry systems rely on major hardware modifications making the methodology difficult to reproduce. The motivation of this work is, by taking advantage of the dynamic nature of flow cytometry sample detection and applying digital signal processing methods, to measure fluorescence lifetimes using an unmodified flow cytometer. We collect a new lifetime‐dependent parameter, referred to herein as the fluorescence‐pulse‐delay (FPD), and prove it is a valid representation of the average fluorescence lifetime. To verify we generated cytometric pulses in simulation, with light emitting diode (LED) pulsation, and with true fluorescence measurements of cells and microspheres. Each pulse is digitized and used in algorithms to extract an average fluorescence lifetime inherent in the signal. A range of fluorescence lifetimes is measurable with this approach including standard organic fluorophore lifetimes (∼1 to 22 ns) as well as small, simulated shifts (0.1 ns) under standard conditions (reported herein). This contribution demonstrates how digital data acquisition and signal processing can reveal time‐dependent information foreshadowing the exploitation of full waveform analysis for quantification of similar photo‐physical events within single cells. © 2014 The Authors. Published by Wiley Periodicals, Inc.

     
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  4. ; ; ; ; ; ( , Lab on a Chip)
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